Cas蛋白（CRISPR-associated proteins），即CRISPR相关蛋白，是一种核酸内切酶，能够识别DNA序列，并切割DNA双链，实现基因的定向修改。cas这个概念首次出现在2002年Ruud. Jansen于Molecular microbiology杂志上发表的文章中，他们通过计算机分析发现了cas相关基因，鉴定了4个在细菌和古菌中的cas基因，包括cas1、cas2、cas3和cas4，其总是位于CRISPR基因座附近，表明和CRISPR基因座具有功能相关。其中Cas3和Cas4蛋白氨基酸序列存在保守结构域，根据氨基酸序列比对推测Cas3可能存在核酸解旋酶活性，Cas4可能存在核酸外切酶活性。研究提示Cas蛋白可能在CRISPR基因座中发挥作用^[1]。此后，相关核心蛋白Cas家族不断扩展与演化，呈现出令人惊叹的功能多样性。

CRISPR基因座及全部四个cas基因的遗传结构示意图^[1]

2005年，法国科学家Alexander Bolotin发现了一个新的与CRISPR关联的cas基因，其中被称为Cas5的大蛋白（>1100aa）引起人们的关注，它可能参与DNA的切割^[2]。在同一年，Haft等人通过系统分析，识别并命名了多个与CRISPR系统相关的新蛋白家族，其中包括Csn1。Csn1被归类为与CRISPR位点紧密相关的蛋白质家族之一^[3]。

随着CRISPR-Cas系统研究地不断深入，时间来到2011年，在Makarova等人于发表的综述文章中首次系统地将CRISPR–Cas系统划分为三大类，并对各类系统中的关键蛋白进行了统一命名。在该文中，原先被称为Cas5、Csn1或Csx12的蛋白被正式命名为Cas9，且属于II型系统，并发现从侵袭的DNA中选择间隔区前体（原间隔区）似乎是通过识别原间隔区相邻基序（PAM）来确定的^[4]。

随后在2012年的Jennifer与Emmanuelle在文献中彻底解析了Cas9蛋白的作用机制。Cas9蛋白含有两个具有切割活性的结构域：HNH结构域和RuvC结构域，HNH结构域切割互补DNA链，而RuvC结构域切割非互补DNA链。其特性是依赖NGG型PAM（靶点下游3bp），像一把魔力剪刀切割DNA双链并产生平末端。优势在于操作简单、技术成熟、基因编辑效率高；劣势则是易引发脱靶风险。

Cas9 结构域结构的示意图（来自Emmanuelle Charpentier，2012）

近岸蛋白开发的Cas9蛋白（Cat.No.:E365）以及Cas9蛋白突变体（Cat.No.:E376、Cat.No.:E377、Cat.No.:E378、Cat.No.:E379），在蛋白两端加入核定位信号（NLS），可使蛋白进入细胞核内进行基因组编辑，配合一对gRNA使用，可实现Cas9 Nuclease相同的基因编辑效果，由于有效的识别序列由20bp增加至40bp，能明显降低脱靶风险，高效助力基因编辑！

图例）将不同Cas9/sgRNA RNP复合物通过电转方式递送至293T细胞，48h后收集细胞，抽提基因组DNA。T7EI检测结果表明：相同条件下，近岸蛋白的Cas9蛋白切割效率要优于其他同类品牌。

2015年，张锋团队发现了新型V型CRISPR系统代表酶——Cas12a（原名Cpf1），它具有与Cas9不同的特性，识别的是TTTV（V=A/C/G）型的PAM序列；切割DNA后会产生黏性末端，更利于基因插入修复；仅需crRNA单链引导，无需tracrRNA，简化了编辑系统；蛋白结构更小，更适合病毒载体包装和体内递送。

Cas12a蛋白的RuvC和核酸酶叶（NUC）结构域具有裂解活性。一旦Cas12识别到PAM序列，就会使得crRNA与目标DNA链之间互补配对形成R-loop，Cas12a蛋白利用其RuvC结构域活性，在PAM序列的帮助下切割非目标链。Cas12a蛋白的切割功能被激活后，会切割周围的非特异性单链DNA，这种现象被称之为反式切割，这一特性可被用作核酸探针。

Cas12b（又名C2c1）最早是在2015年被Kira S. Makarova等人作为一种新型CRISPR效应蛋白在系统分类学研究中提出的，并在随后几年中被进一步功能化、应用化。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，来源于嗜酸耐热菌如Alicyclobacillus acidoterrestris，具有较高切割活性。Cas12b的最佳切割反应温度为48℃。与Cas12a类似，Cas12b识别5'-TTN型PAM序列，切割DNA后产生粘性末端。不同的是，Cas12b依赖双RNA导向（crRNA和tracrRNA，或连接后形成的sgRNA）。此外，Cas12b不仅可以应用于靶标dsDNA的切割，还可以用于靶标核酸的快速检测。

近岸蛋白开发的临床级零脱靶率的AaCas12b^Max（Cat.No.:E375）和高编辑效率的enCas12Ultra（Cat.No.:E393），脱靶效率更低，成本更低，是做基因编辑临床级研究的不二之选。

Cas13是专门针对RNA的VI型CRISPR系统，其在2016年由张峰团队研究报道。它不依赖于PAM序列，而是识别protospacer flanking site（PFS），靶向并切割单链RNA（ssRNA）。Cas13使用单一crRNA引导，具备顺式切割（针对目标RNA）和反式切割（激活后非特异性降解周边RNA）能力，因此常被称为“沉默猎手”。由于其对RNA的特异性作用，Cas13不涉及基因组DNA的编辑，安全性更高。它已被广泛应用于病毒检测（如张锋团队开发的SHERLOCK系统）、RNA追踪与调控，甚至在神经科学中用于将RNA输送至特定亚细胞结构。

近岸蛋白开发的LwaCas13a Nuclease（Cat.No.:E381），源自Leptotrichia wadei(Lwa)细菌，采用大肠杆菌重组表达，纯度超过95%，既可以用于体外RNA切割，体外RNA检测，也可用于活细胞RNA的调控、RNA基因编辑，同时也可以用于光学探针生物学标记。

Cas14（现多被归类为Cas12f）属于VII型CRISPR系统，由Makarova等人提出，体积极小，仅约400–700个氨基酸残基，是目前已知最小的CRISPR效应核酸酶之一，因此被称为“暗器大师”。Cas14最初被认为只能靶向单链DNA（ssDNA），无需PAM序列；然而，2024年，张恒团队解析了其机制发现，Cas14可由crRNA-靶RNA配对激活，对mRNA进行高特异性沉默，从而具备RNA调控功能。这一特性使得Cas14成为基因调控和疾病治疗（如靶向mRNA降解）中的极具前景工具。由于不切割DNA双链，Cas14在安全性方面优于传统CRISPR编辑工具，尤其适用于动态调控基因表达，降解病毒RNA（如乙肝、新冠），需要可逆干预的疾病等，是未来的新兴领域。

CRISPR-Cas9、 Cas12a、 Cas14和Cas13a基因编辑系统的基本组件（Feng W et al. 2021） 

从精准剪切DNA的Cas9、到既能切双链DNA又能切单链探针的Cas12，再到RNA的“猎手”Cas13和“暗器大师”Cas14，CRISPR技术正在全速进化。CRISPR系统已不再只是简单的编辑工具，而逐渐变成一整套可调控、诊断甚至治疗的生物技术平台。未来，随着更多CRISPR子系统的发现和工具化，人类将拥有更精细、更安全、更智能的“基因工具箱”去对抗疾病、调控生命。今天关于Cas蛋白的解析就到这里啦！下期近岸蛋白将详细解析CRISPR/Cas系统的另一个核心组件sgRNA，下期不见不散！